Analysis of LACS Enzyme Activity
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脂肪酸β氧化过程（β-oxidation）在动物组织的线粒体发生的脂肪酸代谢通路，可概括为活化、转移、β氧化及最后经三羧酸循环被彻底氧化生成CO~2~和H~2~O，并释放能量等四个阶段。脂酰辅酶A合成酶（acyl coA synthetase；EC.6.2.1.3），又称为脂肪酸硫激酶（fatty acid thiokinase）或脂酰辅酶A连接酶（acyl coA ligase），是脂肪酸进入β-氧化前的活化所必需：在ATP、CoA-SH、Mg2+存在下，催化饱和或不饱和直链脂肪酸分子（C4）连接辅酶A合成相应的脂酰辅酶A。
脂酰辅酶A合成酶分成三种底物特异性的种类：小于4个碳（C4）的短链脂酰辅酶A合成酶（acetyl-CoA synthetase），介于4至12个碳（C4－C12）的中链脂酰辅酶A合成酶（butyryl-CoA synthetase），和大于12个碳（C12）的长链脂酰辅酶A合成酶（palmitoyl CoA synthetase）。
基于长链脂肪酸棕榈酸（palmitate）和辅酶A在长链脂酰辅酶A合成酶(LACS)的作用下，产生棕榈酰辅酶A（palmitoyl-CoA）后，通过肌激酶（myokinase）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase）和乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase）系统，测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）的变化（340nm波长），来定量分析长链脂酰辅酶A合成酶的活性。
LACS反应过程：
Protein expression
利用原核表达的方法，纯化浓缩获得所需要的蛋白。
- 扩增目的基因的全长，并克隆至pET28b载体中，然后转化至表达宿主菌株BL21 Rosetta。
- 用0.05 mM IPTG（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside）诱导OD600=0.3-0.6的菌株。16°C，120 rpm过夜培养16 h。
- 收集及破碎菌株，用Ni-NTA beads进行纯化，若浓度不够，还需进行浓缩。
Reagents prepare
在正式开始实验前，需要准备好所需的试剂，方便实验进行。主要为预混液premix以及各底物母液配置。
预混溶液的母液配置
其中MgCl~2~和KCl可以称量配制500 ml所需的质量，即分别为2.033*5=10.165 g和0.3728*10=3.728 g。然后，将其加入至500 ml Tris-HCl溶液中，配制成含1 M Tris-HCl（pH7.5）、100 mM MgCl2和100 mM KCl的母液。这三者最终工作液浓度均是稀释10倍，且不会反应。
| Stock solution | Volume，mol*V*MW = mass（g） |
|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH7.5) MW: 121.1 | 500 mL, 1*0.5*121.1=60.55 |
| 200 mM dithiothreitol MW: 154.3 | 5 mL, 0.005*0.2*154.3=0.1543 |
| 250 mM ATP MW: 551.4 | 4.0 ml, 0.25*0.004*507.18=0.5514 |
| 100 mM MgCl2 MW: 203.3 | 100 mL, 0.1*0.1*203.3=2.033 |
| 100 mM KCl MW: 74.55 | 50 mL , 0.1*0.05*74.55=0.3728 |
| 50 mM CoA MW: 767.5 | 4 mL, 0.05*0.004*767.5=0.0154 |
| 50 mM NADH MW: 741.6 | 1 mL, 0.05*0.001*741.6=0.0371 |
| 100 mM phosphoenolpyruvate salt MW: 267.22 | 2.5 mL, 0.1*0.0025*206.13=0.0515 |
底物母液配置
脂肪酸根据碳链长度分为短链脂肪酸（SCFA：小于6个C，挥发性脂肪酸）、中链脂肪酸（MCFA：6-12个C，主要是辛酸C8和癸酸C10）和长链脂肪酸（LCFA：大于12个C）。一般C原子小于10的低级脂肪酸易溶于水，随着C原子继续增加，溶解度减小，溶或者不溶于水，但溶于有机溶剂。除特殊说明，可以使用5% Triton X-100来配制5 mM的C~10~以上的脂肪酸底物。
| Substrates | MW，mol，Volume | mol*V*MW=mass （g） |
|---|---|---|
| Sodium acetate | C2:0 MW: 82.03 50 mM 10 mL | 0.05*0.01*82.03=0.041 |
| Sodium butyrate | C4:0 MW: 110.09 5 mM 10 mL | 0.005*0.01*110.09=0.0055 |
| Sodium hexanoate | C6:0 MW: 138.14 5mM 10mL | 0.005*0.01*138.14=0.0069 |
| Sodium octanoate | C8:0 MW:166.19. 5mM 10mL | 0.005*0.01*166.19=0.0083 |
| Sodium decanoate | C10:0 MW:194.25. 5mM 10mL | 0.005*0.01*194.25=0.0097 |
| Sodium dodecanoate 月桂酸钠 | C12:0 MW:222.30. 5mM 10mL | 0.005*0.01*222.30=0.0111 |
| Sodium myristate 肉豆蔻酸钠 | C14:0 MW:250.35. 5mM 10mL | 0.005*0.01*250.35=0.0125 |
| Sodium palmitate 棕榈酸钠 | C16:0 MW:278.41. 5mM 10mL | 0.005*0.01*278.41=0.0139 |
| Sodium stearate 硬脂酸钠 | C18:0 MW:306.46. 5mM 10mL | 0.005*0.01*306.46=0.0153 |
| Sodium linoleate 亚油酸钠 | C18:2 MW:302.4. 5mM 10mL | 0.005*0.01*302.4=0.0151 in 10% TritonX-100 |
| 12-oxo-phytodienoic acid （C18H28O3） | OPDA MW: 292.4 (1ug/uL in 100% ethonl) | Take 50uL to dry down and resuspend in 100uL 10% TritonX-100 will give the concentration of 1709.9uM, 1.71mM. |
| Dinor-12-oxophytodienoic Acid (C16H24O3) | OPDA-2 MW:264.4 | |
| Tridecanoic acid | C13:0 | |
| Undecanoic acid | C11:0 | |
| 11- Methyldodecanoic acid (11- methyllauric acid) | CAS:5681-98-1 |
Enzyme activity assay
- 5% Triton X-100（v/v）配制5 mM的脂肪酸底物。
- 准备酶活分析的预混溶液，均分为95 µl至每个96孔UV板。
| Stock solution | Working concentration | Volume in 10 ml | Volume in 7 ml |
|---|---|---|---|
| 1M Tris-HCl(pH7.5) MW:121.1 | 0.1M Tris-HCl(pH7.5) MW:121.1 | 1 mL | 0.7 mL |
| 200 mM dithiothreitol MW:154.3 | 2 mM dithiothreitol MW:154.3 | 100 uL | 70 uL |
| 250 mM ATP MW: 551.4 | 5 mM ATP 551.4 | 200 uL | 140 uL |
| 100 mM MgCl2 (included in Tris) | 10 mM MgCl2 | 0 mL | |
| 100 mM KCl (included in Tris) | 10 mM KCl | 0 mL | |
| 50 mM CoA 767.5 | 0.5mM CoA 767.5 | 100uL | 70 uL |
| 50 mM NADH 741.6 | 0.25 mM NADH 741.6/ 1mM | 50 uL/200 uL | 35 uL/140 uL |
| 100 mM phosphoenolpyruvate salt MW: 267.22 | 1 mM phosphoenolpyruvate salt MW: 267.22 | 100 uL | 70 uL |
| Myokinase M3003 Sigma (2268.11 unit/mg, 3 mg/mL) | 20 units myokinase | 40 uL | 28 uL |
| Pyruvate kinase 10128155001 Roche (200 units/mg at RT, 10 mg/mL) | 10 units pyruvate kinase | 50 uL | 35 uL |
| Lactate dehydrogenase 10127230001 Roche (550 units/mg at RT, 5 mg/mL) | 10 units lactate dehydrogenase | 40 uL | 28 uL |
| 5 mM fatty acyl substrate | 250 uM fatty acyl substrate | 5 uL in 100 uL reaction for 1/10 D | 2 uL in 100 uL for 1/50 dilution |
| H2O | 8.3 mL | 5.75 mL |
- 加入5 µl（1-2 µg）纯化的目的蛋白，开始反应。
- 在酶标仪中，设置30°C的温度,OD~340nm~处读数40 min，每隔5 min读取一次。
Reference
- Patel SS and Walt DR. (1987). Substrate specificity of acetyl coenzyme A synthetase. Journal of Biological Chemistry 262: 7132–7134.
- Fan PX, Wang PP, Lou YR, Leong BJ, Moore BM, Schenck CA, Combs R, Cao PF, Brandizzi F, Shiu SH, and Last RL. (2020). Evolution of a plant gene cluster in Solanaceae and emergence of metabolic diversity. eLife 9: e56717.
